CRISPR/Cas9 sistemi ile genom düzenlenmesindeki son gelişmeler

…CRISPR-Cas savunma sistemi organizmanın bir virüs tarafından enfekte edilmesiyle başlar. Ardından bu virüsün DNA’sı hücre tarafından parçalanır ve bu parçalar arasından bir ön-aralık (protospacer) geni seçilir…

19 Şubat 2019 122 0

Bakteri ve arkelerin doğuştan gelen bağışıklık sistemi genellikle virüslerin tutunduğu reseptörlerin yapısını değiştirmek ve restriksiyon – modifikasyon enzimleri yardımı ile konak hücreye girmiş virüs DNA’sını kesmek şeklinde işler. Bununla birlikte son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu canlıların edinilmiş bağışıklık mekanizmasına da sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu sayede omurgalılara özgü olduğu düşünülen edinilmiş bağışıklık sisteminin, prokaryotlarda da var olduğu gösterilmiştir. Bilinen arkelerin tamamına yakınında ve bakterilerin bir kısmında bulunan bu sistem CRISPR-Cas sistemi olarak adlandırılır. CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats), canlının DNA dizisi üzerinde, CRISPR lokusunu tanımlayan gen dizileridir. Cas ise bu bağışıklık sisteminde görev alan proteinlerin genel adıdır.

CRISPR-Cas savunma sistemi organizmanın bir virüs tarafından enfekte edilmesiyle başlar. Ardından bu virüsün DNA’sı hücre tarafından parçalanır ve bu parçalar arasından bir ön-aralık (protospacer) geni seçilir. Seçilen bu gen çeşitli proteinler tarafından işlendikten sonra CRISPR lokusunda lider genin hemen sonrasına, yeni bir tekrar geni ile birlikte eklenir ve aralık (spacer) geni adını alır. Daha sonra bu tekrar ve aralık bölgelerinden sentezlenen CRISPR RNA’lar (crRNA) belirli Cas proteinlerinin de yardımı ile kesilir ve işlenir. İşlenmiş crRNA’lar başka Cas proteinleri ile birleşerek CRISPR ribonükleoprotein komplekslerini (crRNP) oluşturur. Hücrenin aynı virüs ile tekrar enfekte edilmesi durumunda ise virüsün DNA’sına karşılık gelen aralık dizisini taşıyan crRNP’ler virüs DNA’sını tanır ve Cas proteinlerinin nükleaz aktivitesi ile yabancı DNA parçalanır.

Dr. Jennifer Doudna ve ekibi 2012 yılında yayınladıkları bir dizi makale ile bu sistemler üzerinden, DNA üzerinde istedikleri değişiklikleri yapmak için geliştirdikleri tekniği nasıl genetik mühendisliğinde kullanabileceklerini gösterdiler. Bu yöntemde DNA’nın baz dizisine karşılık gelen bir crRNA oluşturulur, bu crRNA Cas proteini ile birleştirilir ve hücrenin içine salınır. Hücre içerisinde crRNP kompleksi, DNA’yı belirlenen bölgelerden keser.

Son yıllarda yapılan; istenen gen bölgesini kesme, etkisiz hale getirme (susturma) veya tamamen değiştirme çalışmaları, CRISPR/Cas9 yönteminin birçok farklı amaçla kullanılabileceğini göstermiştir.

CRISPR/Cas9 çalışmalarının çeşitliliği ve yöntemin geliştirilebilirliği, bu yöntemin daha birçok farklı alanda kullanılabileceğini kanıtlar niteliktedir. Özellikle gelişen gen tedavi stratejileri ile ve diğer genetik hastalıkların tedavisinde kullanımı açısından umut vaat etmektedir.

CRISPR denildiğinde kastedilen, teknik anlamda canlının DNA dizisi üzerinde, CRISPR lokusunu tanımlayan gen dizileridir.

Cas ise bu bağışıklık sisteminde görev alan proteinlerin genel adıdır. CRISPR bölgesi; cas genleri, lider sekans ve lider sekansı izleyen tekrar bölgeleri ve aralık bölgelerinden oluşur. Aralık bölgeleri ve tekrar bölgelerinin birleşimi CRISPR dizisini oluşturur.

Bakteriyel kromozomda bir CRISPR bölgesinin yapısı. (Kaynak: Gün Gök Z. Ve Tunalı B. (2016), CRISPR-Cas İmmün Sisteminin Biyolojisi, Mekanizması ve Kullanım Alanları, Uluslararası Mühendislik Araştırma ve Geliştirme Dergisi, 8(2), 13.)

CRISPR-Cas Sisteminin Genetik Mühendisliğinde Kullanımı

  • Fare Modelinde Huntington Hastalığının Nörotoksisitesinin İyileştirilmesi

Huntington Hastalığı (Huntington’s Disease: HD), Huntington genlerindeki (HTT) poliglutamin tekrarlarından kaynaklanan nörodejeneratif, yani nöronların yapısını bozan ve bu sebeple kas koordinasyonunun yitirilmesine, algısal becerilerin kaybına ve zihinsel erken yaşlanmaya sebep olan, ölümcül bir genetik hastalıktır.

Her ne kadar terapötik strateji olarak mutant HTT (mHTT) ifadesinin baskılanması tedavi için düşünülmüş olsa da farelerde Htt kaybının Embriyonik letaliteye (ölüme) neden olabileceği görülmüş, bunun için de mHTT ekspresyonunun alel spesifik baskılanmasına yönelik çalışmalara yönelinmiştir.

Bu çalışmada, mHTT eksprese eden farelerde CRISPR-Cas9 kullanılarak mHTT’nin polyQ alanı silinmiş ve HTT yığılmalarının etkin bir şekilde tükendiği ve erken nöropatolojiyi zayıflattığı gösterilmiştir.

Çalışmanın, alel spesifik olmayan CRISPR/Cas9 aracılı gen düzenlemesiyle, etkili ve kalıcı olarak poliglutamin artışına aracılık eden nöral toksisitenin ortadan kaldırılması için kullanılabileceği düşünülmektedir.

  • Heterozigot MYBPC3 Mutasyonunun İnsan Embriyolarında Düzeltilmesi

Neonatal kardiyomiyopati; Sol ventrikülün anterior duvarını etkileyen, asimetrik sol ventrikül hipertrofisi (LVH) ile karakterize bir myokard hastalığıdır. Sarkomer proteinlerini kodlayan birçok gende mutasyon sonucu meydana gelen heterojen bir bozukluktur. Olgularda ani ölüme neden olabilen aritmiler, myokardiyal iskemi ve kalp yetmezliği için risk mevcuttur.

Bu çalışmada, insan preimplantasyon embriyolarında, heterozigot MYBPC3 (Neonatal kardiyomiyopati) mutasyonun endojen, germline spesifik DNA tamir yanıtını aktive ederek, belirli CRISPR/Cas9 baz hedef doğruluğu ve yüksek homoloji odaklı tamir verimi ile düzeltilmesi çalışması yapılmıştır. Sunulan yaklaşımın veriminin, doğruluğunun ve güvenilirliğinin; preimplantasyon genetik teşhisini tamamlayarak insan embriyolarında kalıtsal mutasyonların düzeltilmesinde kullanılabileceğini gösterdiği düşünülmektedir.

  • İnsan Embriyolarında ß-Talasemi Mutantının Düzeltilmesi

Talasemiler; Otozomal resesif geçiş gösteren, hemoglobin (Hb) zincirlerinden birinin veya birkaçının hasarlı sentezi sonucu gelişen anemi ile karakterize heterojen bir grup hastalıktır. ß-talasemide genel moleküler patoloji, beta gen bölgesindeki tek nokta mutasyonudur.

Bu mutasyonun insan embriyolarında düzeltilmesinin, hastalığın gelecek nesillere aktarılmasını ve anemi ilaçlarının kullanılmasını önleyebileceği düşünülmüştür ve CRISPR-Cas9 sistemi kullanılarak HBB mutantını düzeltme çalışması yapılmıştır. Üretilen (çalışılan) embriyolarda baz düzeltme ile gen düzeltme verimliliğinin %23,0’ın üzerinde olduğu, bu embriyoların hala mozaik olmasına rağmen tamir edilen blastomerlerin yüzdesinin %20,0’nin üzerinde olduğu görülmüştür. İnsan somatik hücrelerinde ve embriyolarında genetik hastalığın baz düzeltme sistemi ile tedavi edilmesinin uygulanabilirliği gösterilmiştir.

  • İnsan Hücrelerinde Ve Heterozigot Embriyolarda Marfan Sendromu Patojen FBN1 Mutasyonunun Düzeltilmesi

Marfan sendromu (MFS); Fibrilinin ve başlıca bağ doku bileşenlerinden biri olan elastik liflerin yapısını kodlayan fibrillin-1 (FBN1) genindeki mutasyondan kaynaklanır.

Bu çalışma, baz düzenleme sisteminin avantajlarından yararlanarak, ilk olarak insan hücrelerinde ve daha sonra insan zigotik embriyolarında bir MFS patojenik FBN1 mutasyonunun spesifik olarak düzeltmesi çalışmasıdır. Çalışmanın, MFS için gen terapisinin teknik fizibilitesi için bir prensip kanıtı sunduğu düşünülmektedir. Sonuçlarda, BE3’ün (base editor 3)  yaklaşık %89’luk verimlilikte mükemmel düzeltmeye aracılık ettiği ve tüm genom dizileme analizi ile birleştirilmiş yüksek verimli derin dizileme ile numunelerdeki test edilen sahalarda hedef dışı ve indel tespit edilmediği aktarılmıştır.

Kaynaklar:

  • Özer, O (2014), Prokaryotlarda Hücre Savunması ve Evrimi: CRISPR-Cas Sistemi, 3 Şubat 2019 tarihinde Evrim Ağacı https://evrimagaci.org/prokaryotlarda-hucre-savunmasi-ve-evrimi-crisprcas-sistemi-407 adresinden alındı.
  • Yang, S. et al. (2017), CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington’s disease, The Journal of Clinical Investigation, 127(7), 2719-2724.
  • Bakırcı, Ç. (2018), Huntington Hastalığı Nedir?, 3 Şubat 2019 tarihinde Evrim Ağacı https://evrimagaci.org/huntington-hastaligi-nedir-665 adresinden alındı.
  • 4.Ma, H. et al. (2017), Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos, Nature, 548, 413-419.
  • Liang, P. et al. (2017), Correction of β-thalassemia mutant by base editor in human embryos, Protein and Cell, 8(11), 811-822.
  • Zeng, Y. (2018), Correction of the Marfan Syndrome Pathogenic FBN1 Mutation by Base Editing in Human Cells and Heterozygous Embryos, Molecular Therapy, 26(11), 2631-2637.

 

Seher Pektopal

Seher Pektopal Diğer Yazıları
BENZER KONULAR
YORUM YAZ